Métodos de estudio de las proteínas


Métodos de estudio de las proteínas

Las estructuras y actividades de las proteínas pueden ser estudiadas in vitro, in vivo e in silico. Los estudios in vitro de proteínas purificadas en ambientes controlados son útiles para comprender de qué manera una proteína lleva a cabo su función: por ejemplo, los estudios de cinética enzimática exploran los mecanismos químicos de la actividad catalítica de una enzima y su afinidad relativa por diferentes sustratos moleculares. Por su parte, los experimentos in vivo pueden aportar información sobre el papel fisiológico de una determinada enzima en el contexto de la célula o incluso de todo un organismo. Los estudios in silico usan métodos computacionales para el estudio de las proteínas.

Purificación de proteínas

Para realizar el análisis in vitro de una proteína, esta debe ser separada de otros componentes celulares. Este proceso generalmente empieza con la lisis de la célula, en la cual se destruye la membrana celular y su contenido se libera formando una solución llamada lisado crudo. La mezcla resultante puede ser purificada utilizando centrifugación diferencial, que separa los distintos componentes celulares en fracciones que contienen proteínas solubles; lípidos y proteínas de membrana; orgánulos celulares y ácidos nucléicos. La precipitación por un método que se basa en la utilización de elevadas concentraciones salinas puede concentrar las proteínas del lisado. Diversos tipos de cromatografía se usan para aislar la proteína o proteínas de interés basándose en propiedades como la masa molecular, carga neta o afinidad de unión. El nivel de purificación puede ser monitorizado empleando varios tipos de electroforesis en gel si se conocen la masa molecular y el punto isoeléctrico de la proteína estudiada, por espectroscopía si la proteína tiene características espectroscópicas distinguibles, o bien por ensayos de enzimas si la proteína tiene una actividad enzimática. Además, las proteínas pueden ser aisladas según su carga por medio de la técnica de isoelectroenfoque.

Para las proteínas naturales, pueden ser necesarios varios pasos de purificación para obtener proteína suficientemente pura para su uso en laboratorios. Para simplificar este proceso se utiliza a menudo la ingeniería genética para añadir características químicas a la proteína que faciliten su purificación, sin alterar su estructura o función. Como ejemplo, se le puede unir al final de la proteína una etiqueta consistente en una secuencia de aminoácidos específica, a menudo una serie de residuos de histidina. Como resultado, cuando el lisado se hace pasar por una columna de cromatografía que contenga níquel los residuos de histidina se unen al níquel y anclan la proteína a la columna mientras que los componentes no etiquetados del lisado pasan sin impedimento.

Localización celular

*Proteínas localizadas en distintos compartimentos celulares y estructuras etiquetadas con proteína verde fluorescente (que aquí se ve blanca).

El estudio de las proteínas in vivo trata de conocer cual es la localización y el lugar de síntesis de la proteína en la célula. Aunque muchas proteínas intracelulares se sintetizan en el citoplasma y las proteínas de membrana o secretadas en el retículo endoplasmático, los detalles de cómo las proteínas son dirigidas a orgánulos o estructuras celulares específicas no se conocen bien. Una técnica útil para estimar la localización celular utiliza la ingeniería genética para expresar en la célula una proteína de fusión o quimera formada por la proteína natural de interés unida a un reportero como la proteína verde fluorescente. La localización en la célula de la proteína fusionada puede ser visualizada de forma clara y eficiente por microscopía, como se ve en el ejemplo de la figura.

Otro método para elucidar la localización celular de las proteínas de marcadores de compartimento conocidos para regiones como el retículo endoplasmático, aparato de golgi, lisosomas, vacuolas, mitocondrias, cloroplastos, membrana plasmática, etc. Con el uso se versiones etiquetadas con fluorescencia de estos marcadores o de anticuerpos para marcadores conocidos se facilita la localización celular de una proteína de interés. Por ejemplo, la inmunofluorescencia indirecta permite la colocalización por fluorescencia y la demostración de la localización. Las tinciones fluorescentes se usan para etiquetar compartimentos celulares con un propósito similar.

Existen otras posibilidades. Por ejemplo, la inmunohistoquímica utiliza un anticuerpo específico de una o varias proteínas de interés que están conjugadas a enzimas que producen señales por luminiscencia o cromogénicas que pueden detectarse y compararse entre muestras, lo que permite obtener información sobre la localización celular de las proteínas. Otra técnica aplicable es la cofraccionación en gradientes de sacarosa (u otro material) utilizando la centrifugación isopícnica o diferencial.


Fuente: Wikipedia

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